Estudio in vivo sobre la interacción de nanocopos de borofeno con el escarabajo Tenebrio molitor: viabilidad de hemocitos y corto

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11823 (2023) Citar este artículo

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La familia de materiales a base de grafeno dio la bienvenida a un nuevo miembro, el borofeno, en 2014. Todavía se desea encarecidamente realizar investigaciones sobre rutas de síntesis y estudios experimentales sobre propiedades fisicoquímicas y biológicas (especialmente in vivo) para evaluar su potencial práctico como forma de administración de fármacos. sistema. Hasta el momento no se ha estudiado el efecto de los nanocopos de borofeno bidimensionales en las células, los sistemas y en todo el organismo animal. Por lo tanto, investigamos in vivo su biocompatibilidad con hemocitos en el Tenebrio molitor como organismo modelo. Estudios a corto plazo demostraron que los nanohojuelas de borofeno en dosis de 0,5, 1 o 2 µg de nanohojuelas por insecto no inducían hemocitotoxicidad. Los hemocitos expuestos a nanocopos mostraron morfología, adhesividad y capacidad para formar filopodios como en los hemocitos de control. Un estudio detallado indica que los nanocopos de borofeno no: (i) generan especies reactivas de oxígeno intracelular en los hemocitos, (ii) afectan el potencial de membrana mitocondrial y (iii) interfieren con la fagocitosis. Por lo tanto, esta contribución presenta nuevos conocimientos in vivo sobre el grupo de materiales bidimensionales que son uno de los materiales más prometedores para aplicaciones biomédicas debido a su estructura especial y propiedades únicas. Sin embargo, aún son necesarios estudios a largo plazo en insectos y otros animales para confirmar que el borofeno es biocompatible y biológicamente seguro.

El desarrollo de nanomateriales ha aumentado significativamente en los últimos años, donde se pueden distinguir diferentes estructuras morfológicas: cero-dimensional (0D), unidimensional (1D), bidimensional (2D) y tridimensional (3D). La estructura 2D más popular, el grafeno, atrajo mucha atención a esas arquitecturas bidimensionales, lo que impulsó el desarrollo y la fabricación de otros materiales nuevos: dicalcogenuros de metales de transición (TMD), nitruro de carbono grafítico (gCN), nitruro de boro hexagonal (hBN), fósforo negro (BP), etc. El grafeno en forma de óxido de grafeno (GO) tiene amplias aplicaciones potenciales en los campos de la administración de fármacos, la bioimagen, la biodetección o incluso la ingeniería de tejidos1. Sin embargo, se demostró que GO causa citotoxicidad, donde ingresa al citoplasma y al núcleo de las células, lo que conduce a la apoptosis celular inducida. Además, también se acumula en los tejidos del riñón y del pulmón y es difícil de eliminar2,3,4. La reducción de GO debido al cambio de la estructura anfifílica de GO provocó dificultades en la partición de lípidos, suprimiendo la hemólisis. Está claro que para las estructuras basadas en grafeno la toxicidad depende en gran medida de su tamaño, grupos funcionales y tamaño lateral5. Las pruebas de toxicidad in vivo también demuestran la correlación entre las propiedades estructurales del grafeno y la concentración de las dosis y los puntos de entrada en los organismos vivos. A diferencia de los derivados del grafeno, los TMD muestran una menor citotoxicidad cuando les expusimos células epiteliales del pulmón humano (A549). MoS2, WS2 y WSe2 presentaron baja toxicidad incluso en concentraciones altas (200 µg/mL)6. Las pruebas in vivo procesadas en ratones demostraron que MoS2 es biocompatible y puede usarse en la terapia de tratamiento de tumores7. MoS2 también se puede utilizar debido a su compatibilidad como biosensor biodegradable8. Además, un estudio dependiente del tamaño sobre la biocompatibilidad in vitro del nitruro de carbono grafítico demostró que 10 nm y 160 nm son biocompatibles. Sin embargo, el gCN con un tamaño de 20 nm mostró la viabilidad celular más baja. El gCN se aglomeró mayoritariamente alrededor de los núcleos, sin embargo, no penetró9. Otro miembro de la familia 2D: el nitruro de boro hexagonal (hBN) (~ 120 nm de diámetro) no causó ningún daño pulmonar en dosis bajas. Sin embargo, en otros órganos, cuando la dosis era de 1600 µg/kg provocaba daños en pulmón, hígado, riñón, corazón o bazo10. La BP también se puede utilizar como una alternativa exitosa a los medicamentos duros en la quimioterapia. Se demostró que BP mataba células cancerosas (HepG2) y era biocompatible con células normales (QSG-7701). Por lo tanto, la BP podría utilizarse como una herramienta inorgánica en un tratamiento del cáncer menos dañino11. Está claro que muchos factores (como el tamaño lateral, las propiedades de la superficie, los grupos funcionales en la superficie y las diferentes dosis) afectan la biocompatibilidad y la toxicidad de los nanomateriales 2D. Sin embargo, es crucial probar las estructuras 2D en experimentos tanto in vitro como in vivo. Recientemente, los miembros 2D descubiertos, como el borofeno, deben investigarse con cautela por su posible biocompatibilidad o toxicidad. Sin embargo, todavía hay espacio en el estado del arte para la investigación dedicada a los nanocopos de borofeno en su forma prístina, especialmente en lo que respecta a las pruebas in vivo.

El borofeno, mencionado por primera vez en 2014, es un nuevo supermaterial 2D monoelemental que ha atraído una gran atención de los investigadores debido a sus excelentes propiedades químicas, eléctricas, mecánicas y térmicas 12. Este nuevo material ha sido sintetizado por primera vez por dos grupos individuales: Mannix et al. al.13 y Feng et al.14 por deposición en el sustrato de plata en condiciones UHV a partir de un sustrato sólido de alta pureza en 2015. Se ha considerado ampliamente como un nanomaterial prometedor por su posible aplicación en los campos de equipos electrónicos y biomedicina15,16 ,17,18,19,20,21,22. Es un material teranóstico y de administración de fármacos prometedor debido a sus propiedades materiales y contraste fotoacústico y fluorescente para imágenes, además de las propiedades terapéuticas fototérmicas y fotodinámicas21. El borofeno se puede funcionalizar con moléculas fluorescentes para obtener imágenes de fluorescencia in vitro o in vivo para rastrear las vías de absorción y la localización celular de los nanosistemas basados en borofeno y, en consecuencia, localizar con precisión tumores neoplásicos23,24. Por ello, es necesario comprender su interacción con el organismo de los animales y del hombre. Recientemente también se ha demostrado la actividad antibacteriana de las nanoplaquetas de borofeno25 frente a Staphylococcus aureus, Pseudomonas aureginosa, Escherichia coli y actividad antifúngica frente a Candida albicans y Aspergillus brasiliensis. Sin embargo, hasta el momento no se ha revelado el mecanismo de la actividad inhibidora contra los microorganismos patógenos bacterianos y fúngicos del borofeno25. Por tanto, está claro que el estado actual de la técnica no proporciona conocimientos fundamentales sobre la actividad biológica del borofeno in vitro e in vivo sobre células, tejidos, órganos y el organismo de los animales. Sólo se ha sugerido que el borofeno puede ejercer un efecto citotóxico en las células debido a sus bordes altamente reactivos que pueden causar una mayor generación de especies reactivas de oxígeno (ROS)21,25.

Por lo tanto, en este estudio, examinamos el efecto in vivo de los nanoflakes de borofeno sobre la viabilidad y función de las células inmunocompetentes del insecto (hemocitos) y su capacidad para producir ROS en estas células. Las pruebas de biocompatibilidad de las nanocopos de borofeno se realizaron en el insecto Tenebrio molitor26, que es un modelo experimental conveniente para estudios integrales in vivo de los efectos de las nanopartículas en diversos parámetros fisiológicos cruciales para la vida animal27,28,29. Además, los hemocitos de los insectos presentan numerosas similitudes estructurales y funcionales con los glóbulos blancos de los mamíferos, lo que los hace aún más interesantes de estudiar. Tanto los hemocitos de insectos como los leucocitos de mamíferos desempeñan un papel crucial en la defensa del organismo contra los patógenos. Los neutrófilos, los macrófagos, algunas células dendríticas de los mamíferos y los plasmatocitos y granulocitos de los insectos son todos capaces de fagocitosis. Pueden fagocitar y digerir partículas extrañas, como patógenos o desechos celulares, como parte de la respuesta inmune celular30. Los hemocitos de los insectos y ciertos leucocitos de los mamíferos, como los neutrófilos y los macrófagos, producen y liberan péptidos antimicrobianos (AMP) para combatir las infecciones. Aunque los AMP específicos pueden diferir, se conserva la función general de defensa antimicrobiana. Tanto los insectos como los mamíferos poseen receptores tipo Toll expresados en sus hemocitos/leucocitos que desempeñan un papel fundamental en el reconocimiento de patrones moleculares conservados presentes en los patógenos, desencadenando respuestas inmunitarias30. Algunos leucocitos y hemocitos también tienen la capacidad de modular las respuestas inmunitarias; liberan diversas moléculas proinflamatorias, como citocinas y quimiocinas, que reclutan y activan otras células inmunitarias en el lugar de la infección o lesión. Participan en los procesos de reparación de tejidos y cicatrización de heridas contribuyendo a eliminar los desechos celulares, promoviendo la regeneración de los tejidos y modulando el proceso de reparación mediante la secreción de factores de crecimiento y componentes de la matriz extracelular31.

En este caso, las investigaciones a corto plazo revelaron que los nanohojuelas de borofeno en diferentes dosis (0,5, 1 o 2 µg de nanohojuelas por insecto) no inducían hemocitotoxicidad. Los hemocitos expuestos a la presencia de borofeno indicaron morfología, adhesividad y capacidad para formar filopodios igual que en los hemocitos de referencia. Lo que también es crucial, los nanocopos de borofeno aumentaron significativamente el poder reductor de los hemocitos, no generaron especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares en los hemocitos, no afectaron el potencial de membrana mitocondrial y no interfirieron con la fagocitosis.

En primer lugar, el boro en masa y las escamas de borofeno sintetizadas se estudiaron mediante difracción de rayos X (DRX) que se presenta en la Fig. 1. La estructura del boro en masa está compuesta principalmente de icosaedro B12, lo que da lugar a diferentes estructuras basadas en variaciones de unidades básicas32. Los difractogramas XRD indican que ambas estructuras representan los reflejos B12, que se describen como la unidad básica del borofeno de pocas capas, ~ 2Θ: 11°, 17,3°, 20,7°, 23,5°, 31°, 34,5°, 35,5°, 37°. , 38,2°, 44°, 51,5°, 59°. El proceso sonoquímico de exfoliación proporciona algunos cambios estructurales. El boro a granel es una estructura bastante amorfa con amplios reflejos no nítidos, compuesta de B12; cuando se exfolia, los reflejos se vuelven más agudos y distinguibles. También se le puede asignar la estructura más clara y cristalina del borofeno, sin fase amorfa. El cambio de los reflejos del borofeno a valores angulares más altos puede atribuirse a la reducción de los parámetros de la red.

Difractograma XRD de boro a granel (azul) y borofeno (gris oscuro).

El tamaño lateral y la altura de las escamas de borofeno se determinaron mediante un microscopio de fuerza atómica (AFM) presentado en la Fig. 2.

Imagen AFM de borofeno (izquierda) y distribución de altura de las escamas de borofeno (derecha) basada en perfiles AFM.

El tamaño de las escamas tenía un diámetro de ~ 55 a ~ 549 nm. Sin embargo, los perfiles de altura de las escamas de borofeno se distribuyeron entre ~ 2 y ~ 9 nm con la fase principal de ~ 4,5 nm. Por lo tanto, en esta investigación se estudiarán escamas de borofeno con una altura promedio de ~ 4,5 nm correspondientes a ~ 8 escamas.

La medición del potencial zeta (ζ) se realizó para determinar la carga superficial y la estabilidad general de la suspensión (Fig. 3, izquierda).

Potencial Zeta ζ (izquierda) y medición de la estabilidad de la dispersión (derecha) de boro y borofeno a granel.

Para ello, se prepararon suspensiones homogéneas de escamas de boro y borofeno a granel en agua destilada con una concentración de 1 mg/mL. Todas las mediciones se realizaron con triple replicación. El valor obtenido fue −38 ± 3,5 mV y −32,4 ± 0,7 mV para boro y borofeno a granel, respectivamente. Claramente, después de la exfoliación, el valor ζ disminuyó (estadísticamente insignificante; p > 0,05), lo que indica que la superficie del borofeno cambió en comparación con el boro en masa. Sin embargo, los valores de ambas muestras son típicos de una dispersión bien estabilizada (para una buena estabilidad, valores ζ > 30 mV o < -30 mV)33. Las imágenes de dispersiones acuosas de escamas de borofeno y boro en masa (Fig. 3, derecha) demuestran una buena estabilidad incluso después de 24 h. Una dispersión ligeramente mejor del boro en masa se puede atribuir a un valor ζ más alto y, por tanto, a fuerzas de repulsión más fuertes. La estabilidad de la dispersión de borofeno a base de agua también se estimó mediante una absorbancia de la solución de nanomaterial con una concentración de 1 µg/µL en 2 h y se presenta en la Fig. 4. Demuestra que los nanohojuelas de borofeno no se aglomeran significativamente en Este período se puede atribuir a la afinidad del borofeno por el agua y está de acuerdo con la medición del potencial zeta (ζ). Los resultados indican que se pueden aplicar suspensiones prístinas de escamas de borofeno a base de agua en nuestros experimentos in vivo sin necesidad de agregar ningún estabilizador como el PEG, que se usa ampliamente en la investigación basada en grafeno sobre sistemas biológicos para evitar la aglomeración de partículas.

Estabilidad de la dispersión de borofeno en agua (1 µg/µL) basada en la absorbancia de la solución (intensidad del pico 554 nm).

Los hemocitos de los insectos que circulan libremente en el sistema de circulación abierta de los insectos muestran numerosas similitudes estructurales y funcionales con los glóbulos blancos de los mamíferos34 y son muy sensibles a la acción de diversos factores bióticos y abióticos34. Por ello, son un modelo perfecto para la detección in vivo de efectos citotóxicos inducidos por nanomateriales27,28,29. En el estado actual de la técnica hay muchos informes de que los nanomateriales de grafeno, después de entrar en el cuerpo con la sangre y/o atravesar barreras fisiológicas, llegan a diversos órganos, donde se acumulan en diferente medida. En estos órganos pueden provocar reacciones inflamatorias agudas y crónicas mediante daño en el ADN, autofagia y necrosis, o pueden inducir apoptosis celular35. Por lo tanto, es crucial verificar la acción biológica del borofeno como un nuevo miembro de la familia 2D y llenar el vacío en la investigación sobre los efectos in vivo e in vitro de los nanoflakes de borofeno en animales y células humanas que no se ha estudiado hasta el momento.

En primer lugar, para evaluar la morfología y el daño celular, se observaron los hemocitos expuestos al borofeno mediante microscopía de contraste de fases (Fig. 5A, B) y microscopía de fluorescencia (Fig. 5C-F). Las imágenes de contraste de fase de hemocitos expuestos a nanoescamas de borofeno (a una dosis de 2 µg de nanoescamas por insecto) no demostraron cambios en la morfología celular. Los hemocitos expuestos a nanoescamas tenían la misma capacidad de adherirse a los cubreobjetos y formar filopodios largos durante la adhesión que los hemocitos de control (Fig. 5A, B).

Morfología y viabilidad de los hemocitos de Tenebrio molitor dos horas después de la inyección de nanoescamas de solución salina o borofeno (a una dosis de 2 µg de nanoescamas por insecto). Las imágenes de Nomarski no mostraron diferencias en la morfología y adhesión de los hemocitos expuestos a (A) solución salina y (B) borofeno. Los hemocitos de insectos inyectados con nanocopos eran tan capaces de formar numerosos y largos filopodios como las células de control. Las imágenes de microscopía de fluorescencia de hemocitos de control y expuestos a borofeno no mostraron apoptosis inducida en los hemocitos después de la inyección de solución salina (C) y nanocopos de borofeno (D); las caspasas activas (1–9) se tiñeron con SR-VAD-FMK (sin rojo = sin caspasas activas) y el ADN se tiñó con DAPI (azul). El tinte MitoTracker Red CMXRos (rojo) se acumuló en las mitocondrias de hemocitos expuestos a solución salina (E) o nanoescamas de borofeno (F), lo que demuestra que las nanoescamas de borofeno no cambiaron el potencial de membrana mitocondrial y las mitocondrias estaban activas. Barras de escala: 20 µm. (G) Ensayo metabólico de células Alamar Blue para hemocitos incrustados expuestos a borofeno a una dosis de 0,5, 1 o 2 µg de nanoescamas por insecto. Los datos se presentan como media ± DE (n = 6); los asteriscos denotan diferencias entre poblaciones (*p < 0,02, **p < 0,05).

Es bien sabido que altas concentraciones de grafeno alteran la dinámica y la integridad de la membrana plasmática durante su internalización y, en consecuencia, inducen la muerte celular. Por ejemplo, se ha demostrado que la exposición de células de cáncer de mama MDA-MB-23136 y MCF-7, cáncer de páncreas Panc-137 y cáncer de pulmón GLC-8238 a altas concentraciones de GO indujo una pérdida de la integridad de la membrana de las células como resultado de la invaginación y alteración de la membrana celular en el sitio de interacción entre las nanoescamas de grafeno y la membrana39. Además, las nanohojas GO internalizadas se observaron cerca de los filamentos de actina F de los preosteoblastos MC3T3-E1 murinos (A) y los macrófagos RAW-264.7 murinos. La presencia de nanohojas de GO dentro del citoesqueleto provocó cambios en el ciclo celular, apoptosis y estrés oxidativo en estas células40.

En nuestro trabajo, se supone que si las nanoescamas de borofeno alteran la integridad de la membrana celular de los hemocitos y se ubican dentro de los microfilamentos de actina F, estos cambios deberían inducir apoptosis en los hemocitos expuestos al borofeno. Es más, la apoptosis implica, entre otras cosas, la fragmentación del ADN y la activación de enzimas marcadoras apoptóticas, las caspasas, que reconocen y escinden proteínas celulares diana que conducen a la muerte celular. Para dar respuesta a esta hipótesis se han realizado una serie de experimentos. La Figura 5D presenta claramente el análisis de fluorescencia de la viabilidad de los hemocitos mediante tinción SR-VAD-FMK. Demostró que los nanocopos de borofeno no inducían la activación de caspasas (1-9) y la tinción DAPI mostró que no había fragmentación del ADN en los núcleos de los hemocitos expuestos a los nanocopos. Estos resultados podrían sugerir que las nanoescamas de borofeno no se acumulan dentro del citoesqueleto de los hemocitos.

Debido a las observaciones descritas anteriormente, es muy interesante investigar la producción potencial de ROS en los hemocitos de insectos expuestos a las nanoescamas de borofeno. Se ha demostrado que el principal mecanismo de citotoxicidad de las especies de grafeno bidimensional es el estrés oxidativo, que es el resultado de un aumento del nivel de ROS en la célula y del daño de la membrana celular causado por las nanopartículas41,42,43,44. A su vez, el aumento de la producción de ROS es uno de los principales factores que conducen a la muerte celular apoptótica por peroxidación lipídica inducida por ROS, daño al ADN y activación de caspasas44,45,46,47,48. Las mitocondrias son reconocidas como la principal fuente de ROS en las células44,49. Para detectar cambios en el potencial de membrana mitocondrial, se utilizó un tinte fluorescente específico que se acumula exclusivamente en las mitocondrias activas, MitoTracker Red CMXRos. Como se muestra en la Fig. 5F, los nanocopos de borofeno inyectados en el insecto (a una dosis de 2 µg de nanocopos por insecto) no cambiaron el potencial de la membrana mitocondrial, como lo demuestra la acumulación de fluorocromo en las mitocondrias con morfología normal. Este resultado indica que la producción de ROS en las mitocondrias de los hemocitos no aumenta bajo la exposición a los nanoescamas de borofeno inyectados en el insecto en una dosis probada. Posteriormente, para confirmar la falta de aumento en la producción de ROS intracelular en los hemocitos expuestos al borofeno, se aplicó un reactivo reductor, DCFH2-DA. Reacciona con ROS en las células y luego se oxida a DCF fluorescente. Este estudio no confirmó ningún aumento en los niveles de ROS en los hemocitos expuestos a los nanoescamas de borofeno a la dosis de 0,25, 0,5, 1 o 2 µg de nanoescamas por insecto (Fig. 6C-F) en comparación con el control (Fig. 6A). Por otro lado, la producción de ROS aumentó significativamente en los hemocitos expuestos al peróxido de hidrógeno (Fig. 6B). Otro indicador de viabilidad celular, alamarBlue, está idealmente configurado para detectar oxidación a lo largo de la cadena de transporte de electrones mitocondrial y, por lo tanto, lo utilizamos para estudiar la supervivencia de los hemocitos expuestos a dosis crecientes de nanoescamas de borofeno (0,5,1 o 2 µg de nanoescamas por insecto) y para confirmar la falta de citotoxicidad de los nanoflakes de borofeno en los hemocitos (Fig. 5G). Este estudio mostró un aumento dependiente de la dosis en el poder reductor natural de los hemocitos expuestos a dosis crecientes de nanoescamas de borofeno, lo que demuestra un aumento en la viabilidad de los hemocitos expuestos al borofeno en comparación con el control.

Producción intracelular de ROS en los hemocitos de Tenebrio molitor 1 h después de una inyección de solución salina (A), inyección de peróxido de hidrógeno 40 nM (B), inyección de 0,25 (C), 0,5 (D), 1 (E) o 2 µg (F ) de nanocopos de borofeno por insecto. La intensidad de la fluorescencia verde del DCF indica la concentración de ROS en los hemocitos expuestos al peróxido de hidrógeno (control positivo). La tinción con DCFH2-DA de hemocitos expuestos a solución salina (control negativo) o nanoescamas de borofeno a las dosis probadas no mostró generación de ROS en estas células. Barras de escala: 20 µm.

Se ha demostrado que la internalización de los nanomateriales relacionados con el grafeno en las células está fuertemente influenciada por el tamaño de las partículas; Las nanohojas GO recubiertas de proteínas de tamaños grandes y pequeños fueron absorbidas por las células principalmente mediante fagocitosis y endocitosis mediada por clatrina, respectivamente50. Los procesos celulares que median la fagocitosis están impulsados por un conjunto diverso de mecanismos moleculares e implicaciones biofísicas del ensamblaje del citoesqueleto y la remodelación en la membrana del fagocito51. Aquí, el tamaño lateral de los nanocopos de borofeno utilizados en los experimentos osciló entre ~ 55 y ~ 550 nm y su espesor fue de ~ 4,5 nm (Fig. 4) y cuando se inyectó la solución de nanocopos de borofeno Alexa Fluor 647 en el hemocele del insecto, Las nanoescamas fluorescentes se fagocitaron y agregaron efectivamente en el citoplasma de los hemocitos (Fig. 7B) en contraste con los hemocitos de insectos de control inyectados solo con solución salina (Fig. 7A). Posteriormente, en el experimento que muestra la influencia de los nanoflakes de borofeno en la fagocitosis de otro objetivo abiótico, se demuestra que estos nanoflakes (en todas las dosis probadas) no afectaron la fagocitosis de las perlas de látex (Fig. 7C-G).

Actividad fagocítica de los hemocitos de Tenebrio molitor expuestos a solución salina (A) y 2 µg de Alexa Fluor 647-borofeno (B) o expuestos a solución salina (C), 0,5 (D), 1 (E) y 2 µg (F) de borofeno y luego se le inyectaron perlas de látex fluorescentes. Imágenes representativas de microscopía fluorescente que muestran hemocitos expuestos a solución salina adhesiva o Alexa Fluor 647-borofeno teñidos con Oregon Green 488-faloidina para visualizar el citoesqueleto de actina F y DAPI para visualizar el ADN (A, B), nanocopos de Alexa Fluor 647-borofeno (rojo) envuelto por hemocitos indicados por flechas blancas (B). Las imágenes de microscopía representativas de Nomarski muestran la fagocitosis de perlas de látex fluorescentes por hemocitos de insectos inyectados con solución salina y nanoescamas de borofeno (D – F). Las flechas negras muestran fagocitos con perlas de látex fluorescentes (verde). Barras de escala: 20 µm. (G) Se midió el porcentaje de hemocitos expuestos a solución salina y borofeno que contenían perlas de látex (media ± SEM, prueba t de Student).

Estos resultados sugieren que durante la fagocitosis de las nanoescamas de borofeno o la fagocitosis de las perlas de látex por hemocitos previamente expuestos a las nanoescamas de borofeno, las nanoescamas no interfieren con la remodelación del citoesqueleto y la formación de filopodios, que son precursores necesarios de la formación de fagosomas51. La falta de cambios en la viabilidad de los hemocitos expuestos a los nanocopos, su capacidad para formar largos filopodios durante la adhesión y para fagocitar las perlas de látex confirman nuestra hipótesis sobre la no acumulación de los nanocopos de borofeno en la red de actina F que forma la citoesqueleto de hemocitos. Curiosamente, esto va en contra de la investigación basada en el grafeno. Se ha informado que el GO de tamaño micro indujo respuestas inflamatorias mucho más fuertes, mientras que las láminas de grafeno de tamaño nanométrico mostraron una mejor biocompatibilidad en los macrófagos52. Otro estudio demostró que el grafeno después de la internalización se acumuló en el citoplasma, el espacio perinuclear y el núcleo celular de los macrófagos de ratón, induciendo citotoxicidad al (1) aumentar las ROS intracelulares (2) reducir el potencial de membrana mitocondrial e (3) inducir la apoptosis mediante la activación de la vía mitocondrial53. A su vez, nuestros estudios previos en T. molitor demostraron que la inyección o aplicación tópica de nanodiamantes o nanohojuelas de nitruro de boro hexagonales exfoliadas funcionalizadas con hidroxilo (h-BN-OH-n) tampoco afectaron la adhesión, la viabilidad y la función compleja de la célula. membrana de los hemocitos y no interfirió con la fagocitosis de las perlas de látex. Sin embargo, el inmunoensayo a largo plazo demostró que h-BN-OH-n perjudicó la formación de nódulos en el hemocele de los insectos después del desafío bacteriano como resultado de la disminución mediada por h-BN-OH en la capacidad de los hemocitos para reconocer bacterias. migran hacia ellos o forman macroagregados a su alrededor27,28. Este resultado sugiere que el estudio a largo plazo de la respuesta inmune de los hemocitos expuestos al borofeno es necesario para tener una respuesta completa sobre la biocompatibilidad in vivo de este nanomaterial.

En resumen, llenamos el vacío en la investigación sobre la interacción in vivo de nanoescamas de borofeno 2D con hemocitos del escarabajo T. molitor, revelando que el nanomaterial no induce hemocitotoxicidad en estudios a corto plazo en dosis de 0,5, 1 o 2 µg de nanoescamas por insecto. Se detectó que la morfología, la adhesividad, la capacidad de formar filopodios largos y la viabilidad de las células eran las mismas que en los hemocitos de control. Además, los resultados indican que los nanocopos de borofeno aumentaron el poder reductor de los hemocitos y no generaron especies reactivas de oxígeno intracelular en los hemocitos ni afectaron el potencial de membrana mitocondrial. La prueba de la actividad inmunológica de los hemocitos demostró que los nanocopos no influyen en la fagocitosis. Por lo tanto, esta contribución presenta nuevos conocimientos sobre el grupo de materiales 2D que son uno de los materiales más prometedores para aplicaciones biomédicas debido a su estructura especial y propiedades únicas. Sin embargo, aún son necesarios estudios in vivo a largo plazo en insectos y otros modelos animales para confirmar de manera inequívoca que el borofeno 2D es biocompatible y un nuevo nanomaterial biológicamente seguro para su uso en la industria y la medicina.

El polvo de boro (B, CAS: 7440-42-8) se adquirió de Sigma Aldrich (EE. UU.).

El potencial zeta se midió en un Zeta Sizer (ZS Nano ZEN 3600, Malvern) para determinar el potencial superficial. La microscopía de fuerza atómica [AFM MultiMode 8 (Bruker)] proporciona información sobre el espesor y el tamaño de la red de materiales exfoliados. El análisis de la composición de fases y cristalinidad de los materiales se ejecutó mediante difractómetro Aeris (Malvern Panalytical) y radiación Cu-Kα (λ = 1,544 Å). El UV-vis se realizó utilizando un espectrómetro Jasco (Japón).

El borofeno se sintetizó a partir de boro en masa mediante un método sonoquímico presentado en otro lugar54. Brevemente, se dispersaron 300 mg de boro en 80 ml de acetona y se mantuvieron bajo un sonotrodo ultrasónico (Sonics&Materials, 20 kHz) durante 24 h. Posteriormente, la solución se centrifugó a una velocidad de 5000 rpm durante 3 min. El sobrenadante se recogió y se secó primero a 60 °C durante 6 h y a 100 °C durante 12 h en un secador al vacío.

Para demostrar que los hemocitos pueden fagocitar las nanoescamas de borofeno, el nanomaterial se marcó con un tinte fluorescente. Se preparó una solución de 1 µg/ml de Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific) en dimetilformamida (DMF, Sigma Aldrich). Se mezclaron 10 mg de borofeno con 10 ml de Alexa Fluor 647. Después de 24 h, el material se centrifugó (5 min a 5000 rpm), se lavó en DMF y agua y se secó durante la noche a 35 °C.

El borofeno o Alexa Fluor 647-borofeno se disolvió en solución salina fisiológica para Tenebrio para producir soluciones madre de 1 mg/ml. Las soluciones madre preparadas se almacenaron a -30 °C y las soluciones de trabajo se prepararon en solución salina fisiológica justo antes de su uso. Las soluciones de borofeno con diferentes concentraciones se sonicaron durante 15 min a 80 W antes de su uso para evitar posibles agregados.

Se mantuvo un cultivo de T. molitor en el Departamento de Fisiología Animal y Biología del Desarrollo del Instituto de Biología Experimental de la Universidad Adam Mickiewicz en Poznań, Polonia. Todos los escarabajos utilizados en nuestros experimentos derivaron de padres que tenían menos de 1 mes de edad. Los grupos control y experimental se mantuvieron en cajas de plástico separadas en una cámara climática a una temperatura constante de 26 °C, con una humedad relativa de 60 ± 5% y un fotoperiodo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad. Los experimentos se realizaron en quince insectos adultos de 4 días de edad para cada tratamiento. A los insectos se les inyectó una solución de nanoescamas de borofeno a una dosis de 2 µg de nanoescamas por insecto (adhesión de hemocitos, apoptosis de hemocitos, ensayo de mitocondrias activas, fagocitosis de nanoescamas de borofeno Alexa Fluor 647), 0,5, 1 o 2 µg de nanoescamas por insecto ( fagocitosis de las perlas de látex y ensayo alamarBlue) y 0,25, 0,5, 1 o 2 µg de nanoescamas (ensayo ROS).

Los escarabajos de 4 días de edad fueron anestesiados con CO2, lavados en agua destilada y desinfectados con etanol al 70%. Se inyectó solución de nanocopos de borofeno (2 µL, en una dosis de 2 µg por insecto) a través de la membrana ventral entre el segundo y tercer segmento abdominal hacia la cabeza, con una jeringa Hamilton (Hamilton Co., Bonaduz, Suiza). A los insectos de control se les inyectó el mismo volumen de solución salina fisiológica. Todas las inyecciones se realizaron en condiciones estériles. Antes de la recolección de hemolinfa, los escarabajos fueron anestesiados nuevamente con CO2, lavados en agua destilada y desinfectados con etanol al 70%. Tanto los insectos de control como los inyectados con borofeno se tomaron tres horas después de la inyección y se prepararon los hemocitos. Brevemente, se recogieron muestras de hemolinfa (5 µL) con microcapilares "de extremo a extremo" (Drummond Scientific, Broomall, PA, EE. UU.), después de cortar un tarso de una pata delantera. La hemolinfa se diluyó en 20 µl de solución salina fisiológica helada que contenía tampón anticoagulante (4,5 mmol L-1 de ácido cítrico y 9 mmol L-1 de citrato de sodio) en una proporción de 5:1 v/v. La hemolinfa del control y los insectos inyectados con nanocopos se dejaron caer sobre cubreobjetos limpiados con alcohol y recubiertos con 7 µl de poli-l-lisina al 0,01% (Sigma P4707, St Louis, MO, EE. UU.). Se dejó que los hemocitos se asentaran (15 min, a temperatura ambiente) y luego se eliminó el líquido restante. Las células sedimentadas se lavaron dos veces con solución salina fisiológica y se incubaron en solución salina durante 15 minutos. La fijación se logró en paraformaldehído al 4%. Los hemocitos se examinaron con un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE 2000-U equipado con óptica Nomarski para estudiar la adhesión de los hemocitos, las imágenes se documentaron con una cámara digital Nikon DS-1QM.

La citotoxicidad del borofeno se ha evaluado en hemocitos de insectos mediante un bioensayo de hemocitos in vivo como se describió anteriormente55. Brevemente, los escarabajos adultos se dividieron en cuatro grupos experimentales, incluido un grupo de control tratado con solución salina y tres grupos tratados con borofeno. A los grupos experimentales de escarabajos se les inyectó la solución de borofeno (2 µL) a una dosis de 0,5, 1 o 2 µg de nanocopos por insecto, respectivamente, utilizando una jeringa Hamilton (Hamilton Co., Bonaduz, Suiza), mientras que al grupo de control de escarabajos se les inyectó el mismo volumen de solución salina. Una hora después de la inyección, se recogieron muestras de hemolinfa (5 µl); Los hemocitos se prepararon y tiñeron para la detección de caspasa activa utilizando un inhibidor de la actividad de caspasa (1–9) (un derivado de sulforodamina de la fluorometilcetona del ácido valil-alanil-aspártico, SR-VAD-FMK; AK-115, BIOMOL, Plymouth Meeting, PA, EE. UU.) y visualización de núcleos de hemocitos utilizando DAPI. Los hemocitos se examinaron con un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE 2000-U para detectar apoptosis y las imágenes se documentaron con una cámara digital Nikon DS-1QM.

MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes, Eugene, OR, EE. UU.) es un tinte fluorescente rojo que tiñe las mitocondrias en células vivas. A los escarabajos experimentales de 4 días de edad, anestesiados y desinfectados, se les inyectó la solución de borofeno (2 µl) en una dosis de 2 µg de nanocopos por insecto, mientras que al grupo de escarabajos de control se le inyectó el mismo volumen de solución salina. Luego, 20 minutos después de la inyección, a ambos grupos de escarabajos se les inyectó solución MitoTracker Red CMX Ros 1 µM (2 µL) y 40 minutos después de la incubación se recogieron muestras de hemolinfa y los hemocitos se colocaron en cubreobjetos limpios con alcohol y recubiertos con 7 µL al 0,01 %. poli-l-lisina durante 15 min, se lavó con solución salina, se incubó con solución MitoTracker Red CMX Ros 100 nM durante 40 min, se lavó con solución salina y se fijó en paraformaldehído al 4%. Los hemocitos se examinaron con un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE 2000-U para detectar mitocondrias y las imágenes se documentaron con una cámara digital Nikon DS-1QM.

La hemolinfa (3 μl) de insectos inyectados con 2 μl de solución de nanocopos a una dosis de 0, 5, 1 o 2 μg de borofeno por insecto se recogió 1 h después de la inyección y se diluyó en 27 μl de solución anticoagulante. Luego, se mezclaron 5 µl de hemolinfa diluida con 5 µl de solución de azul tripán al 0,4% (Sigma-Aldrich) para medir el número de hemocitos en 1 µl de hemolinfa usando LUNA-II (Logos Biosystems Inc.). La viabilidad de los hemocitos se midió mediante el ensayo alamarBlue (Invitrogen) utilizando una solución a base de resazurina que funciona como indicador de la salud celular al utilizar el poder reductor de las células vivas para medir cuantitativamente la viabilidad. Se colocaron sondas de hemolinfa (10 µl) en una microplaca Nunclon delta de 96 pocillos (fondo plano negro) (Thermo Fisher) y se añadió solución alamarBlue y se incubó durante 4 h (37 °C, 5% de CO2). Al entrar en las células vivas, la resazurina se reduce a resorufina, un compuesto de color rojo y altamente fluorescente. La intensidad de la fluorescencia se leyó utilizando un espectrofluorómetro de microplacas de aparato: Tecan Infinite 200 PRO (Tecan AG) con una excitación de 530 nm y una emisión de 590 nm. La intensidad de fluorescencia de cada sonda de hemolinfa se calculó para 1000 hemocitos.

Los niveles de ROS intracelulares se analizaron utilizando diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (DCFH2-DA), que se escinde mediante esterasas no específicas para generar 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (DCFH2) y se oxida cuantitativamente con ROS para generar 2′ fluorescente. 7′-diclorofluoresceína (DCF)56. En el presente estudio, a los escarabajos de 4 días de edad se les inyectó la solución de nanoescamas de borofeno (2 µL) en una dosis de 0,25, 0,5, 1 o 2 µg de nanoescamas por insecto, mientras que al grupo de escarabajos de control se le inyectó la solución. mismo volumen de solución salina o solución 40 nM de H2O2. Una hora después de la inyección de solución salina, solución de H2O2 o nanoescamas, se recogieron muestras de hemolinfa (2 µL) y los hemocitos se prepararon y utilizaron para la detección de ROS. Para ello, los hemocitos se tiñeron con 10 µM de diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína (DCFH-DA) durante 20 minutos, a temperatura ambiente en la oscuridad. Las imágenes de células vivas se realizaron utilizando un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE 2000-U. Las imágenes fueron tomadas con una cámara digital Nikon DS-1QM.

Se utilizó un bioensayo de fagocitosis in vivo para mostrar la capacidad de los hemocitos para fagocitar las nanoescamas de borofeno. En el primer experimento, se utilizó borofeno fluorescente marcado con Alexa Fluor 647 para investigar si estos nanocopos serían fagocitados por los hemocitos después de su inyección en la hemolinfa del insecto. Los escarabajos T. molitor de cuatro días de edad se dividieron en el grupo de control y el grupo experimental y se anestesiaron, se desinfectaron con etanol al 70% y se lavaron en agua destilada antes del tratamiento con solución salina o Alexa Fluor 647-borofeno. Al grupo de escarabajos de control se le inyectaron 2 µL de solución salina fisiológica, mientras que al grupo experimental se le inyectaron 2 µL de solución de Alexa Fluor 647-borofeno, administrando una dosis de 2 µg de nanoescamas de Alexa Fluor 647-borofeno por insecto. Se recogió hemolinfa de los insectos una hora después de la inyección. Los procedimientos de inyección, recolección de hemolinfa y preparación de hemocitos se realizaron según los métodos descritos anteriormente29. Para visualizar la actina F, los hemocitos se tiñeron con 488-faloidina verde Oregon (ThermoFisher Scientific) y para visualizar los núcleos celulares, las células se tiñeron con solución DAPI (Sigma-Aldrich). Las preparaciones de hemocitos se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE 2000-U para detectar la presencia de nanoescamas de borofeno Alexa Fluor 647 en el interior de los hemocitos. Cada grupo experimental estaba formado por quince insectos.

Simultáneamente con el mismo biotest, estudiamos si, después de fagocitar los nanoescamas de borofeno, los hemocitos conservaban la capacidad de fagocitar otro objetivo abiótico: las perlas de látex fluorescentes27. Brevemente, los escarabajos adultos se dividieron en cuatro grupos experimentales, incluido el grupo de control tratado con solución salina y tres grupos tratados con borofeno. Todos los insectos fueron anestesiados y al grupo de control se le inyectó solución salina fisiológica (2 µL), al primer grupo experimental se le inyectó la solución de nanoescamas de borofeno (2 µL) en una dosis de 0,5 µg de nanoescamas por insecto, al segundo grupo se le inyectó solución salina fisiológica (2 µL). se les inyectó una solución de nanoescamas de borofeno (2 µL) en una dosis de 1 µg de nanoescamas por insecto y el tercer grupo recibió una inyección de 2 µg de nanoescamas de borofeno por insecto. Una hora después de la exposición a la solución salina y a los nanocopos, los insectos se anestesiaron nuevamente, se desinfectaron y se les inyectaron 2 µl de la suspensión de perlas de látex fluorescente (diluida en una proporción de 1:1000 v/v en solución salina estéril; Sigma-Aldrich L1030). Se recogieron muestras de hemolinfa (5 µl) una hora después de la inyección de perlas de látex y se prepararon los hemocitos. Los hemocitos se lavaron con solución salina y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 10 min. Luego, los hemocitos se lavaron nuevamente, se montaron y se examinaron con un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse TE 2000-U equipado con óptica Nomarski. Se eligieron aleatoriamente cinco campos de visión por portaobjetos de vidrio y se calculó el porcentaje de hemocitos que envolvían perlas de látex fluorescentes. Cada grupo experimental estaba formado por quince insectos.

Todos los datos se presentaron como media ± desviación estándar. Los análisis estadísticos se realizaron mediante la prueba t de Student (Graphpad Prism 7.0, San Diego, CA, EE. UU.). Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos comparados.

Los conjuntos de datos utilizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado por el Centro Nacional de Ciencias de Polonia [NCN] con el número de subvención OPUS21 (2021/41/B/ST5/03279).

Departamento de Fisiología Animal y Biología del Desarrollo, Instituto de Biología Experimental, Facultad de Biología, Universidad Adam Mickiewicz de Poznań, Uniwersytet Poznańskiego Str. 6, 61-614, Poznan, Polonia

Elżbieta Czarniewska

Facultad de Tecnología e Ingeniería Química, Departamento de Fisicoquímica de Nanomateriales, Universidad Tecnológica de Pomerania Occidental, Szczecin, Piastow Ave. 42, 71-065, Szczecin, Polonia

Krzysztof Sielicki, Klaudia Maślana y Ewa Mijowska

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EC diseñó y realizó los experimentos biológicos, interpretó los datos biológicos, preparó y revisó el manuscrito, KS & KM realizaron la síntesis y el análisis fisicoquímico, prepararon el manuscrito, EM diseñó la caracterización del material y preparó y revisó el manuscrito. Todos los autores aprovaron el manuscrito final.

Correspondencia a Elżbieta Czarniewska o Ewa Mijowska.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Czarniewska, E., Sielicki, K., Maślana, K. et al. Estudio in vivo sobre la interacción de nanocopos de borofeno con el escarabajo Tenebrio molitor: viabilidad de los hemocitos y efecto de inmunidad a corto plazo. Representante científico 13, 11823 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38595-8

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Recibido: 10 de enero de 2023

Aceptado: 11 de julio de 2023

Publicado: 21 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38595-8

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